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一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用
1.本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù):2.紅色食品是指食品為紅色、橙紅色或棕紅色的食品。這類(lèi)食品富含天然活性植物色素(如番茄紅素、花青素、辣椒紅素、甜菜紅素等)、胡蘿卜素、鐵、蛋白質(zhì)和部分氨基酸,是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、b族維生素和多種無(wú)機(jī)鹽的重要來(lái)源,可以彌補(bǔ)粳米、白面中的營(yíng)養(yǎng)缺失。科學(xué)研究表明,紅色食品有治療缺鐵性貧血和緩解疲勞的作用,對(duì)乳腺癌等腫瘤疾病有防治作用,給人以興奮感,有增加食欲,光潔皮膚,增強(qiáng)表皮細(xì)胞再生和防止皮膚衰老,預(yù)防感冒等作用。經(jīng)常食用紅色食品,可以進(jìn)一步提高對(duì)主食中營(yíng)養(yǎng)的利用率,山楂、紅參等食品還有治療癌癥的功效。被稱為“紅色生力軍?!睜I(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為,紅色蔬果最典型的優(yōu)勢(shì)在于它們都是富含天然鐵質(zhì)的食物,例如常吃的花生、大棗等都是貧血患者的天然良藥,也適合女性經(jīng)期失血后的滋補(bǔ)。所以,紅色蔬果,女人盡可放心多吃。紅色食品中還含有致病微生物的“殺手”一一巨噬細(xì)胞,可以有效地抵御感冒病毒等微生物,增強(qiáng)人體抵抗感冒的能力。3.但是上述涉及的紅色食品傳統(tǒng)的應(yīng)用方法大多作為普通食品或者提取其中的活性天然植物色素進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用,極少關(guān)注其中的蛋白質(zhì)類(lèi)成分??茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn),多種食物的蛋白水解物(小分子肽)具有較強(qiáng)的抗氧化能力,而市面上一些普遍的抗氧化劑如維生素e等,雖然能夠清除活性氧,但對(duì)已造成的損傷修復(fù)效果較弱且會(huì)產(chǎn)生副作用。本發(fā)明對(duì)紅色食品中的復(fù)合小分子肽進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用,彌補(bǔ)了普通抗氧化劑不具有損傷后修復(fù)功能的缺陷,更全面地開(kāi)發(fā)利用了紅色食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。4.采用酶水解蛋白制備抗氧化肽是主流的方法,但由于許多蛋白酶有特異性的酶切位點(diǎn)及蛋白質(zhì)氨基酸序列的獨(dú)特性,因此選用不同的蛋白及酶組合對(duì)于生成具有獨(dú)特功能性的肽化合物具有重要意義。就現(xiàn)有的酶解方法而言,有些使用了無(wú)特異性或廣泛特異性的蛋白酶,這樣的生產(chǎn)重復(fù)性低并且會(huì)產(chǎn)生游離氨基酸,或是肽鏈會(huì)被水解的過(guò)小導(dǎo)致功能性降低,最后產(chǎn)物的收率也較低,總體而言還缺乏穩(wěn)定、高效制備抗氧化肽的方法。5.本申請(qǐng)的發(fā)明人在先申請(qǐng)cna公開(kāi)了一種紅色食品復(fù)合小分子肽及制備方法和在細(xì)胞修復(fù)中的應(yīng)用,包括以下原料:赤小豆、紅米、紅慧米、紅南瓜、花生、大棗、山楂、紅藜麥、枸杞子、洛神花、紅參;所述基于紅色食品原料的復(fù)合小分子肽的制備方法包括以下步驟:原料粉的制備;發(fā)酵產(chǎn)物的制備;酶解產(chǎn)物的制備;復(fù)合小分子肽成品的制備。本發(fā)明提出的復(fù)合小分子肽,具有純天然,無(wú)添加的特點(diǎn),色澤鮮紅誘人,食欲感強(qiáng),食用人群廣,口感好,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,具有修復(fù)受損細(xì)胞、延緩衰老、去除氧自由基、補(bǔ)氣血及增強(qiáng)免疫力的保健功效。但是,由于該多肽水解物中活性成分含量較低,特別是作為活性成分的adf的抗氧化性還有待進(jìn)一步提高,由此所得到的多肽水解物除濕的效果有待進(jìn)一步改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:6.本發(fā)明的目的是提供一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用。具體而言,為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明擬采用如下的技術(shù)方案:7.本發(fā)明一方面涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽,其包括adfw和hadf。8.在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述adfw的含量為0.9wt%以上,hadf的含量為0.7wt%以上。9.本發(fā)明另一方面還涉及含有上述發(fā)酵型小分子肽的水解物,其中包含60wt%以上的短肽,所述短肽是指肽鏈長(zhǎng)度為10個(gè)以下3個(gè)以上的肽。10.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物的制備方法,其特征在于通過(guò)如下步驟制備得到:11.(1)將重量份為赤小豆200~300;紅米紅慧米紅南瓜花生山楂紅糖大棗50~100;紅藜麥枸杞子子猴頭菇粉茯苓10?30;洛神花紅參破壁粉碎,溶解在水中;12.(2)加入纖維素酶和果膠酶的混合物,調(diào)節(jié)ph至4?5,加熱反應(yīng)液至50?60℃,放入攪拌器中,酶促水解1?3小時(shí);13.(3)水解之后加入胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶,攪拌均勻得到反應(yīng)液,調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph至7?8,加熱反應(yīng)液至50?60℃,放入攪拌器中,酶促水解時(shí)間為2?4小時(shí);14.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶,在ph6.5?7.5和50?60℃溫度下進(jìn)行酶促水解3?5小時(shí);15.(5)在熱處理使酶變性;16.(6)離心并回收液相;17.(7)先通過(guò)4?6kda膜對(duì)液相進(jìn)行超濾和滲濾并回收滲透物;18.(8)再通過(guò)150?300da膜對(duì)來(lái)自超濾的滲透物進(jìn)行納米過(guò)濾并回收滲余物;19.(9)進(jìn)行冷凍干燥,得到水解物。20.本發(fā)明另一方面涉及上述小分子肽作為抗氧化劑和/或除濕中的應(yīng)用。21.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物在除濕中的應(yīng)用以及在制備治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹和/或皮膚瘙癢的藥物或食品中的應(yīng)用。22.有益效果23.本發(fā)明通過(guò)采用合適的水解條件,制備得到了富含本發(fā)明小分子肽的水解物,本發(fā)明的小分子肽具有較高的抗氧化活性,由此所得到的多肽水解物對(duì)于除濕,特別是治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢具有重要意義。有望在抗衰老、美容方面取得功效。具體實(shí)施方式24.為了進(jìn)一步理解本發(fā)明,下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;诒景l(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。25.如無(wú)特殊說(shuō)明,本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品,均可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)獲得。26.實(shí)施例1:27.(1)稱量赤小豆300g、紅米300g、紅慧米300g、紅南瓜300g、花生200g、山楂150g、紅糖150g、大棗100g、紅藜麥50g、枸杞子30g、猴頭菇粉30g、茯苓30g、洛神花30g及紅參30g;水清洗干凈,烘干去除水分并使用破壁機(jī)破壁粉碎,備用;28.(2)加入纖維素酶(2.0%/dm)和果膠酶(1.0%/dm)的混合物,調(diào)節(jié)ph至4.5,加熱反應(yīng)液至55℃,放入攪拌器中,在40rpm的條件下反應(yīng),酶促水解2小時(shí);29.(3)水解2小時(shí)之后加入胰蛋白酶(1.5%/dm)和菠蘿蛋白酶(2.0%/dm),攪拌均勻得到反應(yīng)液,調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph至7.5,加熱反應(yīng)液至55℃,放入攪拌器中,在40rpm的條件下反應(yīng),酶促水解時(shí)間為3h;30.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶(1.5%dm),在ph7.0和55℃溫度下進(jìn)行酶促水解4小時(shí);31.(5)在85℃下熱處理45分鐘以使酶變性;32.(6)離心并回收液相;33.(7)先通過(guò)5kda膜對(duì)液相進(jìn)行超濾和滲濾并回收滲透物;34.(8)再通過(guò)200da膜對(duì)來(lái)自超濾的滲透物進(jìn)行納米過(guò)濾并回收滲余物;35.(9)進(jìn)行冷凍干燥,得到水解物。經(jīng)過(guò)測(cè)試,所述水解物中包含62%重量的短肽、27%的多糖以及11%的其它物質(zhì)。36.比較例1:37.參照實(shí)施例1,其區(qū)別在于步驟(3)中不加入胰蛋白酶。由此得到的得到水解物,經(jīng)過(guò)測(cè)試,所述水解物中包含47%重量的短肽、35%的多糖以及18%的其它物質(zhì)。38.比較例2:39.參照實(shí)施例1,其區(qū)別在于步驟(3)中不加入菠蘿蛋白酶。由此得到的得到水解物,經(jīng)過(guò)測(cè)試,所述水解物中包含37%重量的短肽、32%的多糖以及31%的其它物質(zhì)。40.比較例3:41.參照實(shí)施例1,其區(qū)別在于先進(jìn)行步驟(4),再進(jìn)行步驟(3)。由此得到的得到水解物,經(jīng)過(guò)測(cè)試,所述水解物中包含53%重量的短肽、28%的多糖以及19%的其它物質(zhì)。42.對(duì)于上述水解產(chǎn)物,通過(guò)測(cè)定orac值(μmolte/mmol)和dpph值(μmolte/mmol)來(lái)比較其抗氧化活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。43.表1:水解物抗氧化活性測(cè)試結(jié)果44.45.從上述比較結(jié)果來(lái)看,實(shí)施例1的抗氧化活性高于比較例1?3,由此說(shuō)明實(shí)施例1的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性。46.對(duì)于由實(shí)施例1和比較例1?3所得到的水解物,分析其包含的短肽的含量,通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),實(shí)施例1中豐度最高的短肽為adfw和hadf,其含量達(dá)到水解物的0.92%和0.76%,而在比較例中adfw和hadf的含量最高的是比較例3,僅為0.57%和0.53%。47.為了進(jìn)一步確定是否是由于adfw和hadf的存在使得水解物的抗氧化活性較高,對(duì)于檢測(cè)出的豐度較高的短肽,使用通常的肽的化學(xué)合成方法即fmoc固相合成法來(lái)合成,作為抗氧化活性測(cè)定用的樣品,作為比較,以cna所得到的豐度最高的adf作為對(duì)照。對(duì)于合成的短肽,測(cè)定orac值(μmolte/mmol)dpph值(μmolte/mmol),將各肽序列的分析結(jié)果匯總于表2。48.表2:短肽抗氧化活性測(cè)試結(jié)果[0049][0050]基于上表可以看出,通過(guò)同時(shí)包含表現(xiàn)出高orac值和表現(xiàn)出高dpph值的adfw和hadf,從而使得水解物的抗氧化性能全面優(yōu)異,特別是,相比于cna所公開(kāi)的adf,本發(fā)明的肽具有更高的抗氧化活性。[0051]水解物除濕效果:[0052]一、臨床資料[0053]試驗(yàn)方法:隨機(jī)、陽(yáng)性藥對(duì)照臨床研究。[0054]安全性評(píng)價(jià)指標(biāo):一般體格檢查,血、尿、大便常規(guī),肝、腎功能、心電圖,不良反應(yīng)等。[0055]病例數(shù):治療組40例,陰性對(duì)照組40例,陽(yáng)性對(duì)照組40例,共120例,臨床表現(xiàn)丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。[0056]二、試驗(yàn)藥品[0057]治療組:本發(fā)明實(shí)施例1所制備得到的水解物,每次10g,溫開(kāi)水送服,每日3次。[0058]陰性對(duì)照組:不進(jìn)行處理。[0059]陽(yáng)性對(duì)照組:cna實(shí)施例1所制備的小分子肽溶液,每次40g(干物質(zhì)量為10g),加熱后送服,每日3次。[0060]三、受試者治療[0061]療程:1周,觀察期內(nèi),每天隨訪1次,除有嚴(yán)重不良反應(yīng)者外,觀察1周后,一般不再進(jìn)行隨訪。[0062]四、統(tǒng)計(jì)結(jié)果[0063][0064]從上表可以看出,采用本發(fā)明的水解物能夠有效緩解丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。此外,在觀察期間未見(jiàn)明顯不良反應(yīng),也未見(jiàn)肝、腎功能及造血系統(tǒng)損害,表明本發(fā)明的小分子肽使用安全。[0065]以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式,然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)在此公開(kāi)的實(shí)施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和變化。
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